脯氨酸含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
可見(jiàn)分光光度法 ：BC0290 ：50T/48S
提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：4℃保存。（自備）
試劑二：液體45 mL×1瓶， 4℃保存。
試劑三：4℃保存。（自備）
標(biāo)準(zhǔn)品：脯氨酸 10mg，4℃保存。
脯氨酸(Pro)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，逆境條件下，植物體內(nèi)Pro含量顯著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標(biāo)之一。
用磺基水楊酸（SA）提取Pro，加熱處理后，Pro與酸性茚三酮溶液反應(yīng)生成紅色；加甲苯萃取后，在520nm測(cè)定吸光度。
可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、冰乙酸、甲苯、研缽、冰和蒸餾水。
一、脯氨酸含量測(cè)定試劑盒樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：
1、細(xì)胞、細(xì)菌或組織樣品的制備 ：
細(xì)菌或細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，棄上清；按照每100萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），之后置沸水浴振蕩提取10min；10000g，常溫離心10min，取上清，冷卻后待測(cè)。
組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿；之后置沸水浴振蕩提取10min，10000g，常溫離心10min，取上清，冷卻后待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：取100μL血清（漿）加入1mL提取液，充分混勻，之后置沸水浴振蕩提取10分鐘，10000g，常溫離心10分鐘，取上清，冷卻后待測(cè)。
3、標(biāo)準(zhǔn)品的處理：稱取1mg，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為15、10、8、6、4、2、1、0 μg/ml。
二、測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)520nm，蒸餾水調(diào)零。
2、取0.5mL上清液（或稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品）+0.5mL試劑一+0.5mL試劑二于有蓋試管中，置沸水浴中保溫30min（蓋緊，防止水分散失），每10min振蕩一次。
3、待冷卻后，在試管中加入1mL試劑三，振蕩30s，靜置片刻，使色素轉(zhuǎn)試劑三；吸取0.8mL-1mL上層溶液于1mL玻璃比色皿中，用試劑三調(diào)零，于520nm波長(zhǎng)處比色，記錄吸光值。
4、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光值和濃度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
三、Pro含量計(jì)算：
1、通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品脯氨酸含量(y為脯氨酸含量，μg/mL；x為OD值)
2、按照細(xì)菌、細(xì)胞個(gè)數(shù)或者組織鮮重計(jì)算，先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得y值：
細(xì)胞或細(xì)菌中脯氨酸含量(μg/104 cell)= y÷細(xì)胞濃度(104 cell/mL)
Pro含量(μg/g mass) =y÷樣本鮮重(g/mL)
3、血清（漿）中脯氨酸含量，先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得y值：
Pro含量[μg/mL血清（漿）] = y÷0.1mL血清（漿）/mL 提取液中含有蛋白沉淀劑，提取的上清液不能用于蛋白濃度的測(cè)定。