Cell Counting Kit-8 簡稱CCK-8 試劑盒，為MTT法的替代方法，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。可用于藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏等試驗(yàn)。下面介紹一下索萊寶cck8實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)。

一. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定細(xì)胞具體數(shù)量）

1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞到培養(yǎng)板內(nèi)。

2、按比例（例如：1/2比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每個(gè)濃度建議3-6個(gè)復(fù)孔。

3、接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加CCK試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測定OD值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X軸），OD值為縱坐標(biāo)（Y軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK后的培養(yǎng)時(shí)間。）

二. 細(xì)胞活性檢測

1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間（37℃,5% CO2）。

2、向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。

4、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。

5、若暫時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

三. 細(xì)胞增殖-毒性檢測

1、在96孔板中配置100μL的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（37℃，5% CO2）。

2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測物質(zhì)。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24或48小時(shí)）。

4、向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。

5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。

6、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。

7、若暫時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

Note：

1）建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

2）有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK試劑時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基頁面下加，容易產(chǎn)生氣泡，會(huì)干擾OD值讀數(shù)。

3）白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長時(shí)間。

4）當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK溶液。

5）如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450nm濾光片的檢測靈敏度最高。

6）培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對檢測造成影響。