教你成為平淡無奇的WB實(shí)驗(yàn)小能手—樣本制備篇（續(xù)）

更新時(shí)間：2021-01-29

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WB實(shí)驗(yàn)流程

樣本制備的步驟

關(guān)于樣本采集和保存，蛋白提取的相關(guān)

知識(shí)和技巧請(qǐng)查看：

接下來，讓小編帶您總結(jié)關(guān)于蛋白定量和蛋白變性相關(guān)的知識(shí)點(diǎn)：

一

蛋白定量

測(cè)定蛋白常用的方法有Bicinchoninic acid (BCA)法、Lowry法和Bradford法（考染法）

1. BCA法的測(cè)定原理是蛋白質(zhì)將銅離子還原成亞銅離子，后者在堿性溶液中與BCA結(jié)合生成紫紅色結(jié)合物，該復(fù)合物在562nm處有吸光值且與蛋白質(zhì)濃度成正相關(guān)性，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度?？捡R斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)下呈紅色，大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)—色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。

2. Lowry法又稱為Folin-酚試劑法，首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復(fù)合物，然后這一復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin-酚上級(jí)），產(chǎn)生鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物的深藍(lán)色，這種深藍(lán)色的復(fù)合物在745~750nm處有大的吸收峰，顏色的深淺（吸收值）與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750nm的光吸收值大小計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。

3. Bradford法又稱為考染法。染料結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，可檢測(cè)到微量蛋白，操作簡(jiǎn)便，試劑配制極簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，但干擾因素多?？捡R氏亮藍(lán)G-250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當(dāng)它通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變成藍(lán)色，大吸收波長(zhǎng)從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與595nm的吸光度成正比，測(cè)定595nm處光密度值的增加即可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。

三者之中，Lowry法與BCA同屬化學(xué)法，Lowry法是藥典中使用的蛋白濃度測(cè)定方法，但是操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)。BCA法操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短，形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性強(qiáng)，但可能受一些雜質(zhì)影響。Bradford屬于染料結(jié)合法，也易受到去垢劑影響。

二

蛋白變性

蛋白變性常用方式是高溫煮樣，煮樣條件設(shè)置為100℃，根據(jù)樣品量的多少，設(shè)置時(shí)間5~15min，煮樣時(shí)間過長(zhǎng)，一些蛋白可能會(huì)產(chǎn)生聚集性沉淀。疏水性*的蛋白質(zhì)，如含有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，在煮沸時(shí)可能會(huì)發(fā)生聚集或寡聚化，因此，其煮樣條件為40℃~55℃條件下，溫浴10~60min變性。煮樣后的樣本于-20℃或-80℃保存。

提取并定量后，并未加Loading Buffer煮樣的蛋白樣品，保存于-80℃時(shí)，防止反復(fù)凍融，并盡量于1周內(nèi)加Loading Buffer煮樣處理，不要超過2周。

在此，為了幫您更好地完成實(shí)驗(yàn)，我們推薦索萊寶蛋白定量和蛋白變性相關(guān)的配套產(chǎn)品。

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號(hào)
Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒	PC0010
BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒	PC0020
Lowry法蛋白濃度測(cè)定試劑盒	PC0030
4×蛋白上樣緩沖液（含DTT）	P1015
4×蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑）	P1016
4×非變性蛋白上樣緩沖液	P1017

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