Annexin V PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒

品牌：Solarbio | 貨號：CA1030|規(guī)格:25T/50T/100T|保存：2-8度避光保存，勿冰凍。

產(chǎn)品簡介：
細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內轉移到細胞膜外，使 PS 暴露在細胞膜外表面。PS 是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS 暴露在細胞膜外。Annexin V 具有易于結合到磷脂類如 PS 的特性，對 PS 有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的 PS。PS 轉移到細胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用 AnnexinV 與7-AAD 雙染的方法，通過流式檢測細胞早期凋亡。

操作步驟:

1、細胞樣品的準備： a)對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內備用。用不含 EDTA 的胰酶消化細胞，細胞可以被輕輕 用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次 收集到離心管內。1000rpm 左右離心 5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法*離心離心管底， 可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50µl 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約 1ml 4℃預冷的 PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清； b)對于懸浮細胞：1000rpm 左右離心 5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法*離心離心 管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50µl 左右的培養(yǎng)液，以避免 吸走細胞。加入約 1ml 4℃ 預冷的 PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清；

2、用去離子水按 1:3 稀釋結合緩沖液(4ml 4x 結合緩沖液+12ml 去離子水)；

3、用 1x 結合緩沖液重新懸浮細胞，調節(jié)其濃度為 1-5×106 /ml；

4、取 100µl 的細胞懸液于 5ml 流式管中，加入 5µlAnnexin V/PE 混勻后于室溫避光孵育 5 分鐘；

5、加入 10µl 20ug/ml 的 7AAD，并加 400µl PBS，立刻進行流式檢測。

實驗設計：

1）未轉染細胞 空白管：陰性對照組細胞，不加 Annexin V/PE，7AAD。用于調節(jié)電壓； 單染管：陽性對照組細胞，只加 Annexin V/PE 或只加 7AAD。用于調節(jié)補償； 檢測管：處理的細胞，加 Annexin V/PE，7AAD。用空白管和單染管調節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

2）轉染 GFP 未轉染空白管：未轉染細胞，不加 Annexin V/PE，7AAD。用于調節(jié)電壓； 未轉染單染管：未轉染且有明顯凋亡的細胞，只加 Annexin V/PE 或只加 7AAD。用于調節(jié)補償； 轉染 GFP 空白管：轉染 GFP 對照組細胞，不加 Annexin V/PE，7AAD。用于調節(jié)補償 檢測管：處理的細胞，加 Annexin V/PE，7AAD。調節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

注意事項：

1、Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸(PS)親和，而 PS 在不同種屬間沒差異。在正常細胞中，PS 只分布在細胞膜脂 質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，PS 由脂膜內側翻向外側；

2、低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細胞 2～3 次，離心機 4℃1000rpm 5min 離心，處理得當?shù)脑?，胰酶造成損 傷可以控制在 5%以內，有對照組的情況下對實驗結果不會造成明顯影響。

3、先加PI 不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且 PI 本身對細胞也是有毒性的，對實驗結果影響會比胰 酶大，不建議這樣做；

4、Annexin V 是Ca 依賴的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA 螯合了 Ca 離子從而影響 Annexin V，進而影 響結果。

5、用流式檢測凋亡時，PI 受時間的影響很大，因標記了 PI 后會加大細胞毒性，隨著時間延長會導致 PI 的染 色增加，特別是檢測早期凋亡時，如果時間延長除了會導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外，誤差會明顯 加大。一般 PI 加上后立刻上機，然后在一個小時內檢測完成。兩種方法都可以，但是按照我們操作步驟造成 的誤差會更小。

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